人外周血TH1/TH2/TH17細(xì)胞流式檢測(cè)方案（佛波酯離子霉素刺激）

人外周血TH1/TH2/TH17染色

Tips：采集外周血的抗凝管必須是肝素抗凝管，刺激劑盡量選用凍干粉自己配置；cocktail刺激劑是液體形式，PMA會(huì)因保存不當(dāng)導(dǎo)致活性降低，影響刺激效果，而凍干粉形式的PMA較穩(wěn)定，可以保證刺激效果。

人外周血TH1/TH2/TH17染色/流式檢測(cè)

細(xì)胞刺激：（刺激體系1ml）

取人外周血（肝素抗凝）200 ml加入24孔板內(nèi)，加入800 ml的*培養(yǎng)基，再加入1ml PMA(25ug/ml)、1μl Ionomycin（1mg/ml），輕輕吹打混勻細(xì)胞。放入 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)刺激0.5小時(shí)后，每孔再加入2μl Brefeldin A（5mg/ml），輕輕吹打混勻細(xì)胞，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)刺激3.5小時(shí)。

流式檢測(cè)：

1、收集細(xì)胞于流式管內(nèi)，500 g/8min離心，槍頭吸去上清，彈散管底沉淀，加入相應(yīng)的表面染色抗體（CD3\CD8），彈散混勻。室溫避光孵育15分鐘后，500 g/8min離心，槍頭吸去上清；

2、彈散管底沉淀，加入1ml的固定/破膜工作液，（1ml Fixation/Permeabilization Concentrate加入3ml Fixation/Permeabilization  Diluent稀釋），旋渦混勻,現(xiàn)配現(xiàn)用；

3、室溫避光孵育30分鐘， 600 g/10min離心，在吸水紙上倒扣流式管棄去上清（此時(shí)細(xì)胞已在管底形成很牢固的沉淀，不容易丟 失），彈散管底沉淀；

4、加入1ml Permeabilization Buffer(此為10X，須與蒸餾水1：10稀釋成工作液)工作液離心洗滌細(xì)胞，破膜15分鐘（室溫避光）， 600 g/10min，在吸水紙上倒扣流式管棄去上清，彈散管底沉淀；

5、加入100μl Permeabilization Buffer（1x），同時(shí)加入相應(yīng)的細(xì)胞因子染色抗體，室溫避光孵育15分鐘；

6、加1ml Permeabilization Buffer（1x），600 g/ 8min；在吸水紙上倒扣流式管棄去上清；彈散管底沉淀；

7、加入適量體積（建議300~500 ml）的PBS重懸細(xì)胞，并上機(jī)檢測(cè)并分析。

Tips：1、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇相應(yīng)的抗體，并做單染管用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償（具體如何設(shè)置單染管，可參照后文中補(bǔ)償章節(jié)的介紹）。

     2、盡量做同型對(duì)照，因細(xì)胞因子表達(dá)量不高（尤其是IL-4表達(dá)量非常低），細(xì)胞因子抗體對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照一般都要做。

     3、PMA刺激會(huì)導(dǎo)致人T細(xì)胞表面CD4表達(dá)的下調(diào)，PMA與Lonomycin聯(lián)合刺激下調(diào)非常明顯，4h刺激后會(huì)下調(diào)50%以上，6h刺激幾乎檢測(cè)不到CD4，因此我們的界定CD4+T細(xì)胞是通過染CD3和CD8，來圈CD3+CD8-的細(xì)胞。

     4、PMA對(duì)小鼠T細(xì)胞CD4表達(dá)影響很小，因此可以直接染CD4來圈門。

     5、因破膜劑對(duì)細(xì)胞損傷較大，建議離心后形成的細(xì)胞沉淀先彈散形成細(xì)胞懸液，在加入破膜劑，這樣會(huì)減少對(duì)細(xì)胞的損傷（形成的細(xì)胞碎片較少）。

人外周血TH1/TH17染色結(jié)果

注意：細(xì)胞破膜后對(duì)形態(tài)影響較小，因此可以直接圈淋巴門分析，在通過圈CD3+CD8-的細(xì)胞（此處未列出圖）來分析CD4+的細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的量。因此此圖橫坐標(biāo)就直接標(biāo)的CD4。

人TH1/TH2/TH17染色所需抗體及輔助試劑

流式方案BioGems*資料。

背景知識(shí)

TH1/TH2/TH17細(xì)胞[3]

Th細(xì)胞是適應(yīng)性免疫應(yīng)答主要參與者。傳統(tǒng)觀念根據(jù)Th細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子不同將其分為兩型：一型能產(chǎn)生IFN-г的Th1細(xì)胞，在介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答中起重要作用；另一型能產(chǎn)生IL-4的Th2細(xì)胞，它們與體液免疫應(yīng)答有關(guān)。Th1／Th2細(xì)胞由共同前體細(xì)胞即CD4+T細(xì)胞分化而來，CD4+T細(xì)胞活化后，在IL-l2的作用下向Thl細(xì)胞分化。IL-l2是CD4+T細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞的決定因子。IL-l2與IL-12R結(jié)合后誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和STAT4分子的活化，可上調(diào)IFN-г，進(jìn)而活化STAT1分子，并誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化特異性地轉(zhuǎn)錄因子T-bet?；罨腃D4+T細(xì)胞在IL-4作用下向Th2細(xì)胞分化。

Th 17細(xì)胞是一型zui近發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞，主要分泌IL-17A(即IL-17)，與炎性反應(yīng)和自身免疫疾病有關(guān)?；罨腃D4+T細(xì)胞在IL- 21或IL-6與TGF-β的共同作用下，經(jīng)STAT3通路激活視黃酸相關(guān)孤兒核受體(ROR)-гt和ROR-α，zui終分化為Th17細(xì)胞。

PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)是一種佛波酯，常用于激活某些類型的蛋白激酶C(PKC)，如group A (α, βI, βII, γ) 和group B (δ, ε, η, θ)異構(gòu)體。佛波酯(包括PMA)的結(jié)構(gòu)類似于二酰基甘油，可通過與PKC的C1域相互作用而活化PKC異構(gòu)體。通過PCK，PMA也活化某些MAP激酶途徑。PMA高濃度長(zhǎng)時(shí)間作用于細(xì)胞可引起總PKC活性及其成瘤性的降低，而低濃度可能起保護(hù)作用。此外，PMA也促進(jìn)造血分化。PMA的水溶性約是PDBu(phorbol-12,13-dibutyrate)的10倍，提示PMA更適合用于細(xì)胞學(xué)研究。

Ionomycin 離子霉素是Streptomyces conglobatus細(xì)菌生成的一種離子載體。用來提高胞內(nèi)鈣離子濃度，了解鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。也可用于刺激以下胞內(nèi)因子產(chǎn)生：干擾素，穿孔素 ，IL-2和 IL-4，一般和佛波酯聯(lián)合使用。這些細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)中有重要作用。

Brefeldin A布雷菲爾德菌素A通過間接阻止COP-I與高爾基膜的連接，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。

引用

1 BioGems*資料

2 Wiki

3 《Th1、Th2、Th17和Treg研究現(xiàn)狀》 張文林

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