ALL SEQ-Low-Level DNA Detection

Low-Level DNA Detection

1.smMIP

單分子分子反轉(zhuǎn)探針

smMIP方法使用單分子標(biāo)記和分子反轉(zhuǎn)探針來檢測和量化低頻率發(fā)生的遺傳變異 （Hiatt等，2013）。在該方法中，探針用于檢測gDNA中的靶標(biāo)。在復(fù)制探測的靶標(biāo)后，外切核酸酶消化使標(biāo)記物離開靶標(biāo)，隨后進(jìn)行PCR擴增。測序允許靶標(biāo)的高分辨率序列讀取，而更大的深度允許更好地比對每個*的分子標(biāo)簽。

好處：

檢測低頻目標(biāo)

可以對原料有限的樣品進(jìn)行單細(xì)胞測序或測序

臨床樣本中 每堿基誤差為2.6×10 -5 （Eboreime等，2016）

缺點：

PCR擴增錯誤

PCR偏差可以代表富含GC的模板

在PCR期間，聚合酶優(yōu)先擴增小于500bp的靶標(biāo)

2.MIPSTR

smMIPs有針對性地捕獲STR基因座

MIPSTR是一種對許多個體的種系和體細(xì)胞短串聯(lián)重復(fù)（STR）變異進(jìn)行多重基因分型的方法（Carlson等，2015）。該方法是smMIP （Hiatt等，2013） 方法的變體， 并使用新穎的映射策略。

該方法使用具有共同主鏈的smMIP用于PCR引物，測序銜接子，12bp簡并標(biāo)簽和具有基因座特異性和STR側(cè)翼序列的靶向臂。捕獲遺傳多樣性的個體可識別種系STR變異。使用簡并標(biāo)簽識別技術(shù)變異，并且跨標(biāo)簽定義的讀取組的STR變化被認(rèn)為是體細(xì)胞變異。

好處：

能夠區(qū)分技術(shù)錯誤與體細(xì)胞STR突變

缺點：

需要高質(zhì)量的參考基因組

3.MDA

多位移放大

MDA是一種常用于測序微生物基因組的方法，因為它能夠擴增大于0.5 Mbp的模板，但它也可用于研究其他大小的基因組 （Dean et al。，2001）。在該方法中，3'封閉的隨機六聚體引物與模板雜交，然后用Phi 29聚合酶進(jìn)行鏈置換DNA合成。該方法允許有效和快速的DNA擴增。擴增DNA的深度測序提供了讀數(shù)的準(zhǔn)確表示，而測序深度為序列提供了更好的比對和共識。原始MDA方法的幾種變體，如MIDAS （Gole等，2013），ddMDA （Rhee等，2016），SNES （Leung等，2015）和IMS-MDA。（Seth-Smith等，2013）已經(jīng)開發(fā)出來以改善擴增偏差和通量 （Seth-Smith等，2013）。

好處：

模板可以是環(huán)狀DNA（例如，質(zhì)粒，細(xì)菌DNA）

可以對大模板進(jìn)行排序

可以對有*原料的樣品進(jìn)行單細(xì)胞測序或測序

缺點：

強放大偏差; 基因組覆蓋率低至約6％ （Navin et al。，2011）

PCR偏差可以代表富含GC的模板

受污染的試劑會影響結(jié)果 （Woyke等，2011）

4.MALBAC

多次退火和循環(huán)放大的放大周期

MALBAC旨在解決MDA的一些缺點 （Zong等，2012）。在該方法中，MALBAC引物隨機退火至DNA模板。在升高的溫度下具有置換活性的聚合酶擴增模板，產(chǎn)生半胱氨酸。“隨著擴增和退火過程的重復(fù)，半胱氨酸擴增成全擴增子，其末端與5'末端互補。結(jié)果，全擴增子末端雜交形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，抑制環(huán)狀擴增子的進(jìn)一步擴增，而只有半縮樣子和gDNA經(jīng)歷擴增。全擴增子序列的深度測序允許準(zhǔn)確表示讀數(shù)，而測序深度為共有序列提供改進(jìn)的比對。該方法也可以應(yīng)用于cDNA用于轉(zhuǎn)錄組分析 （Briese等，2016）。

好處：

可以對大模板進(jìn)行排序

可以對有*原料的樣品進(jìn)行單細(xì)胞測序或測序

全擴增子環(huán)化抑制模板的過度表達(dá)，減少PCR偏倚

可以擴增富含GC的區(qū)域

提供統(tǒng)一的基因組覆蓋

與MDA相比，等位基因丟失率較低

缺點：

與Phi 29相比，聚合酶相對容易出錯 （Gole et al。，2013）

溫度敏感協(xié)議

提供高達(dá)約90％的基因組覆蓋率 （Lovett等，2013），但基因組的某些區(qū)域的代表性不足（Lasken等，2013）

5.NUC-SEQ / SNES

S期/單核外顯子組測序中細(xì)胞的單個G2 / M核測序

修改的MDA方案nuc-seq利用了細(xì)胞周期的G2_M階段中的單個細(xì)胞具有4個拷貝的基因組的事實。該特性允許細(xì)胞用細(xì)胞分選儀分離，并且它還顯著增加單細(xì)胞的基因組覆蓋度 （Wang等人，2014）。SNES是一種額外的變異，包括外顯子組的靶向選擇和測序 （Leung等，2015）。Div-Seq是一種變體，它將nuc-seq與5-乙炔基-2_-脫氧尿苷（EdU）的增殖細(xì)胞脈沖標(biāo)記相結(jié)合， Habib等，2016）

好處：

nuc-seq：將單細(xì)胞測序的物理覆蓋性能提高到90％以上

SNES：單細(xì)胞中外顯子組覆蓋率為95.94％

SNES：同基因群體中SNV的檢測效率為92.37％

缺點：

nuc-seq：不適用于低增殖率的細(xì)胞

SNES：限于外顯子組

6.OS-Seq

寡核苷酸選擇性測序

開發(fā)OS-Seq是為了通過直接在流動細(xì)胞上捕獲和測序基因靶標(biāo)來改進(jìn)靶向重測序 （Myllykangas等，2011）。在該方法中，使用具有銜接子的靶序列來修飾流動細(xì)胞引物。使用修飾的引物將模板中的靶標(biāo)捕獲到流動池上。進(jìn)一步延伸，變性和雜交提供靶基因的序列讀數(shù)。深度測序提供準(zhǔn)確的讀數(shù)表示。

好處：

可以一次重新排序多個目標(biāo)

無需凝膠切除或窄尺寸純化

快速，單日協(xié)議

樣品可以多路復(fù)用

由于去除了擴增步驟，降低了PCR偏差

避免材料損失

缺點：

引物可以與相似的靶序列相互作用，導(dǎo)致序列模糊

7.Duplex-Seq

雙工序列

Duplex-Seq是一種基于標(biāo)簽的糾錯方法，可提高測序準(zhǔn)確度 （Schmitt等，2012）。在該方法中，將銜接子（具有引物序列和隨機的12bp索引）連接到模板上并使用PCR擴增。深度測序提供來自每個*分子標(biāo)簽的共有序列信息?；诜肿訕?biāo)簽和測序引物，對齊雙鏈體序列，確定每條DNA鏈上的真實序列。估計該方法比傳統(tǒng)NGS準(zhǔn)確度高10,000倍 （Ahn等，2015）。雙重測序的目標(biāo)版本包括2輪捕獲，讀取深度高達(dá)1,000,000x （Schmitt等，2015）

好處：

可以檢測> 10 7個測序核苷酸中的單點突變（Schmitt等，2012），（Schmitt等，2015）

雙工標(biāo)記導(dǎo)致錯誤率極低

可以檢測PCR擴增錯誤并從分析中除去

添加適配器后無需額外的文庫準(zhǔn)備步驟

缺點：

復(fù)雜的文庫構(gòu)建（Stahlberg et al。，2016）