凝膠電泳遷移速率的決定因素你知道有哪些么

  　　凝膠電泳遷移速率的決定因素你知道有哪些么

　　瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場(chǎng)中，在中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽(yáng)極遷移，其遷移速率由下列多種因素決定:

　　1、DNA的分子大小

　　線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。

　　2、瓊脂糖濃度

　　一個(gè)給定大小的線狀DNA分子，其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對(duì)數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%，分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%，DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。

　　3、DNA分子的構(gòu)象

　　DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí)，它在電場(chǎng)中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān)，還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開(kāi)環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度是不一樣的，超螺旋DNA移動(dòng)快，而開(kāi)環(huán)雙鏈DNA移動(dòng)慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時(shí)發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因?yàn)楹衅渌鸇NA引起時(shí)，可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個(gè)回收，用同一種限制性?xún)?nèi)切酶分別水解，然后電泳，如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜，則為同一種DNA。

　　4、電源電壓

　　在低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長(zhǎng)，片段越大，因場(chǎng)強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段有效分離所加電壓不得超過(guò)5V/cm。

　　5、嵌入染料的存在

　　熒光染料溴化乙啶用于檢測(cè)瓊脂糖凝膠中的DNA，染料會(huì)嵌入到堆積的堿基對(duì)之間并拉長(zhǎng)線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強(qiáng)，還會(huì)使線狀DNA遷移率降低15%。

　　6、離子強(qiáng)度影響

　　電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒(méi)有離子存在時(shí)(如誤用蒸餾水配制凝膠)，電導(dǎo)率小，DNA幾乎不移動(dòng)，在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液)，則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。

　　對(duì)于天然的雙鏈DNA，常用的幾種電泳緩沖液有TAE[含EDTA(pH8。0)和Tris-乙酸]，TBE(Tris-硼酸和EDTA)，TPE(Tris-磷酸和EDTA)，一般配制成濃縮母液，儲(chǔ)于室溫。