關于外泌體培養(yǎng)的那些事

什么是外泌體

簡單介紹?下細胞外囊泡（Extracellular Vesicles， EVs）。細胞外囊泡是細胞以多種形式分泌到細胞外的各種囊泡：

其主要分為外泌體（Exosomes）直徑為30-150nm，以內(nèi)吞的形式釋放到細胞外；微囊泡（Microvesicles）直徑為100-1000nm，以出芽的形式釋放到細胞外；凋亡?體（Apoptotic body）直徑為50-2000nm，由凋亡細胞產(chǎn)?。

生理功能：

外泌體是細胞與細胞間通訊中起關鍵作?的胞外基質(zhì)成分，?泛參與細胞間物質(zhì)運輸與信息傳遞，調(diào)控細胞?理活動；同時，外泌體具有抗原提呈、免疫逃逸等免疫調(diào)節(jié)作?和誘導正常細胞轉(zhuǎn)化，促進腫瘤發(fā)?及轉(zhuǎn)移的作?；此外，外泌體還可以作為“天然的納?粒?"來進?藥物遞送，裝載的藥物類型包括?分?化學藥物、蛋?質(zhì)和肽、核酸藥物等。

樣本來源：

目前外泌體研究的樣本主要是以細胞培養(yǎng)上清以及各種體液為主，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等。

分離手段：

外泌體分離的方式方法有很多很多種，這邊就比較其相對的優(yōu)劣勢進行簡單的比較：

1.差速超速離?：差速超速離?是?家最熟悉的?種分離?法，?獻中?得最多的且也是?前?較能受到認可的?法。差速超速離?是先通過低速離?去除細胞和細胞凋亡碎?，再通過超?速去除?囊泡和沉淀外泌體。此?法分離得到的外泌體可?于后續(xù)的鑒定實驗、分?檢測實驗、細胞實驗和動物實驗。

2.密度梯度離?：此?法多指蔗糖密度梯度超速離?。此?法從不同密度的顆粒中分離出囊泡，對離?的時間?較敏感。如果外泌體和顆粒密度相似，外泌體可能會被其他顆粒污染。

3.超濾：超濾過程中需要?超濾膜進?外泌體隔離。在分離過程中，外泌體可能會阻塞過濾孔，導致膜的壽命減短，分離效率較低。同時，外泌體會粘附在膜上，導致產(chǎn)量降低。

4.免疫磁珠法：?包被抗標記物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育后結合，即可將外泌體吸附并分離出來。該?法分離得到的外泌體的?物活性易受pH和鹽濃度影響，不利于下游實驗。

5.試劑盒分離法：?前商業(yè)化的外泌體提取試劑盒多種多樣，提取效果良莠不齊。同時試劑盒本?的價格?較?，且外泌體的得率和純度?般，不是性價??的?種分離?法。

外泌體的鑒定：

外泌體分離之后，需要經(jīng)過?系列鑒定才能確定分離的是外泌體。。下?介紹?種鑒定?法：

1.透射電鏡鑒定法：透射電鏡，全稱為透射電?顯微鏡（Transmission Electron Microscope，簡稱TEM），分辨率為0.1~0.2nm，適合外泌體雙層囊膜超微結構觀察，?于鑒定樣本中是否存在外泌體樣結構，即通常為茶托型或?側(cè)凹陷的半球形。

2.濃度粒徑檢測法：納?顆粒跟蹤分析法，簡稱NTA（Nanoparticle Tracking Analysis），該技術已被外泌體研究領域認可為外泌體表征?段之?。NTA技術的樣本處理簡單、能保證外泌體原始狀態(tài)、檢測速度快，檢測后能提供外泌體粒徑和濃度信息。

3.Western Blot分?標志物檢測： WB可以?來鑒定外泌體的標志蛋?是否存在于樣本中。外泌體標志蛋?包括四跨膜蛋?家族，如CD9、CD63和CD81；細胞質(zhì)蛋?，如肌動蛋?（Actin）和鈣磷脂結合蛋?（Annexins）；參與?物功能的分?，如凋亡轉(zhuǎn)接基因2互作蛋?X（ALIX）、腫瘤易感基因101蛋?（TSG101）、熱休克蛋?（HSP70、HSP90），以及細胞分泌的特異性蛋?。

4.流式細胞術檢測：外泌體可以先進?熒光標記，再通過流式細胞儀檢測外泌體表?標記蛋?。但是傳統(tǒng)的流式細胞儀檢測樣本的顆粒??是300-500nm，?外泌體直接都在300nm以下，因此，可能?量的外泌體檢測不到，造成分析不太準確。

5.ELISA檢測：根據(jù)外泌體的表?標志物，如CD9、CD63進?ELISA實驗，來檢測外泌體的蛋?量，從?實現(xiàn)對外泌體的分析。但是ELISA?法容易受其他抗原的?擾，引起實驗結果出現(xiàn)偏差。

外泌體提取下游實驗：

1.外泌體microRNA測序/芯?：通過對外泌體microRNA的?通量分析，可以找到不同外泌體之間差異表達的microRNA，為后續(xù)的功能學實驗做準備。

2.外泌體mRNA測序/芯?：通過對外泌體轉(zhuǎn)錄組測序或表達譜芯?分析，可以找出不同外泌體之間差異表達的mRNA，從?發(fā)現(xiàn)外泌體中哪些基因發(fā)?了變化。

3.外泌體lncRNA芯?：通過lncRNA芯?可以同時得到lncRNA和mRNA數(shù)據(jù)，為研究者提供更完整的lncRNA和mRNA篩查。

4.外泌體ceRNA芯?：競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）機制如下：microRNA（miRNA）處在調(diào)控?絡的中?，lncRNA分?富含miRNA結合位點，可以競爭性地結合miRNA，解除miRNA對其靶基因的抑制作?，進?調(diào)控基因的表達?平。通過ceRNA芯?可以為研究者提供完整的lncRNA，circRNA和mRNA篩查。

5.外泌體蛋?質(zhì)組學：主要包括iTRAQ蛋?質(zhì)組定量/TMT標記定量蛋?質(zhì)組學/label free蛋?質(zhì)組定量。通過蛋?質(zhì)組學分析，尋找差異表達蛋?，并揭?其細胞?理病理功能。

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