qPCR實驗方法如何選擇：探針法 VS 染料法？

熒光定量 PCR 又稱 qPCR，是一項非常常見的分子生物學(xué)實驗技術(shù)。熒光定量 PCR 熒光為基礎(chǔ)對核酸進(jìn)行定量分析，其應(yīng)用非常廣泛，可以用于檢測基因的表達(dá)量（RNA 的豐度），驗證表達(dá)譜芯片或轉(zhuǎn)錄組測序的數(shù)據(jù)，確定病原體的載量，對片段的拷貝數(shù)（CNV）進(jìn)行分析，對基因進(jìn)行分型等等。

大部分研究者主要的應(yīng)用是對基因的表達(dá)量進(jìn)行測定，其原理為通過監(jiān)控反應(yīng)體系中熒光強(qiáng)度的變化，記錄檢測熒光達(dá)到閾值時的循環(huán)數(shù)（Ct 值）。從理論上說，起始模板量和 Ct 值密切相關(guān)，因此我們通過判讀 Ct 值從而對樣本進(jìn)行定量。

在進(jìn)行熒光定量 PCR 時，從技術(shù)和產(chǎn)品來說，我們往往會有許多選擇，尤其是方法的選擇，對最終結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。熒光定量 PCR 從方法上來說可以分為染料法和探針法兩種。

1、染料法

染料法常采用 DNA 染料 SYBRGreenⅠ，使用簡單，成本也相對較低，因此會有很多國內(nèi)研究者會選擇使用染料法進(jìn)行后續(xù)實驗。

在染料法熒光定量 PCR 實驗中，染料能夠與雙鏈結(jié)合，從而發(fā)光，而在游離狀態(tài)下，SYBR Green I 發(fā)出微弱的熒光。所以，一個反應(yīng)發(fā)出的全部熒光信號與出線的雙鏈 DNA 量呈比列，且會隨擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而增加。但是染料法檢測的是體系中的所有雙鏈 DNA,因此一些非特異性擴(kuò)增或者引物二聚體的出現(xiàn)，會極大的影響真實結(jié)果的準(zhǔn)確性。為此，一些廠商提供 ROX 作為內(nèi)部熒光參考標(biāo)準(zhǔn)，用來校正背景，但是即便如此，染料法特異性的問題依舊無法與探針法相比。另外染料法無法在同一個反應(yīng)中檢測多個目的片段，對于復(fù)雜序列，如果難以擴(kuò)增的話，也會受到脫靶效應(yīng)（如引物二聚體）的影響。在這種情況下，就需要在實驗前期進(jìn)行熔解曲線分析，判斷擴(kuò)增所得產(chǎn)物是否只有一種。

二、TaqMan 探針法

TaqMan 探針法 PCR 擴(kuò)增時，在加入一對擴(kuò)增引物的同時再加入一個特異性的熒光探針。Taqman 探針為一段線性的寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個熒光報告基團(tuán)（FAM 或 Hex 等）和一個熒光淬滅基團(tuán)，當(dāng)探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收，PCR 儀檢測不到熒光信號；當(dāng) PCR 擴(kuò)增時（在延伸階段），Taq 酶的 5' -3' 外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與 PCR 產(chǎn)物形成*同步，這也就是探針法定量的原理。

二者區(qū)別，怎么選擇？

探針法與染料法的最大區(qū)別在于，理論上探針法中的熒光信號只來源于目標(biāo)序列，也就是不受非特異性擴(kuò)增及引物二聚體的影響。除此之外，人們還可以利用不同探針，在一個體系中使用不同的熒光標(biāo)記同時檢測多種指標(biāo)，達(dá)到節(jié)省實驗成本的目的。在樣本量比較大的情況下，成本甚至可以低于染料法。

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