細(xì)胞培養(yǎng)常見問題分析解決

細(xì)胞污染  

凡是對細(xì)胞生長有危害的成分或者造成細(xì)胞不純的異物都視為污染。細(xì)胞污染根據(jù)污染源可以分為化學(xué)污染，物理污染和生物污染。  

化學(xué)污染  

細(xì)胞培養(yǎng)所用到的培養(yǎng)基，水要高壓蒸汽鍋滅菌。其中，血清作為細(xì)胞培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基，血清存在潛在的化學(xué)污染，此外血清成分具有不確定性，血清對不同細(xì)胞的生長影響包括毒副作用等存在差異。  

物理污染  

物理污染，主要指放射線、溫度、振動(dòng)、輻射等物理因素對細(xì)胞的破壞。如將細(xì)胞液培養(yǎng)基等暴露于放射線或紫外線下，會(huì)引起細(xì)胞代謝改變。恒溫培養(yǎng)箱的周圍存在能夠產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)的設(shè)備，可能也會(huì)對細(xì)胞生長存在一定影響。  

微生物污染  

1.細(xì)菌：細(xì)菌污染常見的有大腸桿菌，葡萄球菌等。細(xì)菌污染較易發(fā)現(xiàn)，在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀，培養(yǎng)液一般會(huì)在短時(shí)間內(nèi)變黃，有時(shí)靜置的培養(yǎng)液不混，稍加震蕩，變會(huì)有很多混濁物漂起。顯微鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮，有時(shí)在細(xì)胞表面及周圍有大量細(xì)菌存在，細(xì)胞停止生長并有中毒表現(xiàn)。  

處理：  

在培養(yǎng)液中加入相應(yīng)的抗生素，能夠預(yù)防絕大多數(shù)的細(xì)菌污染  

保證器皿、水充分滅菌，空氣無菌，同時(shí)保證滅菌壓力。  

2、霉菌：霉菌的污染多數(shù)是白色念珠菌，曲霉菌，酵母菌等。霉菌污染后培養(yǎng)液短期內(nèi)依舊清亮不變渾濁，倒置顯微鏡下可看見細(xì)胞之間有交錯(cuò)的絲狀，樹枝狀菌絲，漂浮在培養(yǎng)液中。念珠菌呈卵圓狀，在細(xì)胞周邊生長。細(xì)胞被霉菌污染后，仍可生長，長時(shí)間細(xì)胞的活力狀態(tài)會(huì)變差。  

處理：先確定污染物的種類：細(xì)菌、真菌還是支原體。如果是霉菌污染。迅速將污染細(xì)胞與正常細(xì)胞系隔離，并對實(shí)驗(yàn)中所用過的所有器皿工具消毒  

3、支原體：支原體的大小介于細(xì)菌和病毒之間，是一種獨(dú)立生活的微生物。對熱敏感，對一般抗生素不敏感。支原體的形態(tài)多變，多吸附在細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。電鏡下觀察，中心有高密度的密集顆粒，橫斷面與細(xì)胞微絨毛相似。  

因國內(nèi)的血清很多數(shù)都沒有做支原體陰性檢測，而支原體又是牛血清中最常見的微生物之一。支原體污染細(xì)胞后，培養(yǎng)液輕微發(fā)生混濁．但細(xì)胞變化不顯著，在細(xì)胞逐漸的培養(yǎng)中，細(xì)胞會(huì)慢慢死亡。  

支原體污染檢測：  

熒光染色法：DNA和與DNA特異性結(jié)合的熒光染料結(jié)合，使得支原體的DNA著色，然后用熒光顯微鏡觀察。鏡下支原體為散在于細(xì)胞同圍或附于細(xì)胞膜表面的亮綠色小點(diǎn)。  

解決：  

1.抗生素排除法：支原體污染預(yù)防比解決好。如果不小心污染后，可加入高濃度抗生素（常規(guī)使用的5倍濃度）作用24-48小時(shí)，再換入常規(guī)培養(yǎng)液，但該法不保證有效。推薦用量：慶大霉素200ug/ml,四環(huán)素10ug/ml，卡那霉素50ug/ml。  

2.加溫除菌：支原體不耐熱，可以對支原體污染的細(xì)胞熱處理除菌。將支原體污染的細(xì)胞放置41度中作用10小時(shí)可殺死支原體。因高溫對細(xì)胞本身也會(huì)產(chǎn)生一定影響，故熱處理前需先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定對細(xì)胞影響最小而能大程度的殺死支原體的時(shí)間。  

4、黑蛟蟲：黑膠蟲污染后細(xì)胞中出現(xiàn)小黑點(diǎn)，高倍鏡下可看見不規(guī)則的運(yùn)動(dòng)。培養(yǎng)液渾濁不明顯，對細(xì)胞生長狀態(tài)無太大影響。  

解決：如果細(xì)胞出現(xiàn)黑膠蟲污染，可增加細(xì)胞的接種密度，提高細(xì)胞存活率。當(dāng)細(xì)胞生長狀態(tài)很好時(shí)，黑膠蟲的數(shù)量會(huì)降低。細(xì)胞培養(yǎng)過程中堅(jiān)持要每天換液，并用緩沖液沖洗，能夠大大降低黑膠蟲的數(shù)量，可最終消失，偶爾在鏡下可見個(gè)別小黑點(diǎn)，但整體細(xì)胞培養(yǎng)和后續(xù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染無影響。  

細(xì)胞培養(yǎng)箱染菌清洗方法  

用硫酸銅溶液擦拭CO2孵箱內(nèi)，再把水盤里也加上飽和量的硫酸銅?；蛘咴谂囵B(yǎng)箱的托盤加入飽和的消毒磷酸氫二鈉高鹽液體,可以防止霉菌污染。  

CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有細(xì)胞暫時(shí)轉(zhuǎn)移，采用過氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把過氧乙酸放置在孵箱內(nèi)一個(gè)小時(shí)，使其蒸汽彌漫。待過氧乙酸的氣味消散后，再移入細(xì)胞。孵箱應(yīng)定期清潔（2月左右）。  

其它培養(yǎng)箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外燈照。  

預(yù)防霉菌污染，可在培養(yǎng)基里加3u/ml的兩性霉素或制霉菌素或放線或雙抗；但細(xì)胞一旦污染，制霉菌素或放線或雙抗都無法彌補(bǔ)，舍棄被污染細(xì)胞，并將環(huán)境*消毒。如果所有細(xì)胞都污染，可能是整體系統(tǒng)污染，檢查所有培養(yǎng)基和器材，并重新滅菌。針對個(gè)別污染，首先考慮操作問題，注意操作規(guī)范。