想做好血液RNA-seq實(shí)驗(yàn)？這些經(jīng)驗(yàn)請(qǐng)收好！

血液是一種信息量巨大、獲取方便且微創(chuàng)的樣本類(lèi)型，廣泛用于診斷和臨床研究，以探索疾病的病理和生理機(jī)制以及療法的作用。全血轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是一種基于RNA測(cè)序（RNA-Seq）的方法，可對(duì)全血進(jìn)行深入的基因表達(dá)譜分析，深入了解全系統(tǒng)范圍內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)和豐度。高通量RNA-Seq技術(shù)的發(fā)展使我們能夠以較低的成本收集高質(zhì)量的血液轉(zhuǎn)錄組信息，為發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物、了解藥物反應(yīng)、病理和生理過(guò)程以及疾病的無(wú)創(chuàng)診斷帶來(lái)了革命性的變化。

外周血的優(yōu)勢(shì)在于采集快捷，且可在大規(guī)模人群中實(shí)現(xiàn)。然而，一旦血液離開(kāi)人體，問(wèn)題就來(lái)了。傳統(tǒng)方法需要從全血中分離白細(xì)胞，再提取RNA，以解決血液中污染物的問(wèn)題。如今，專(zhuān)門(mén)為制備血液樣本而開(kāi)發(fā)的方案使我們能夠從全血中獲得高質(zhì)量的RNA-Seq 數(shù)據(jù)。

什么是RNA-seq？ 

RNA-seq即轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（Transcriptome sequencing），廣義的定義為：對(duì)細(xì)胞內(nèi)所有RNA（包括rRNA/ tRNA/ mRNA等）進(jìn)行高通量測(cè)序，狹義的定義為：對(duì)細(xì)胞內(nèi)mRNA進(jìn)行高通量測(cè)序，臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室指的一般為狹義的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

血液樣本

任何血液轉(zhuǎn)錄組分析實(shí)驗(yàn)的第一步都是通過(guò)靜脈穿刺或指針采血。從少量血液中獲取優(yōu)質(zhì)RNA的技術(shù)進(jìn)步，如通過(guò)指針采樣，將使廣泛的研究成為可能，參與者甚至可以進(jìn)行自我采樣。

血液RNA降解可能發(fā)生在采集、儲(chǔ)存和處理過(guò)程中，因此，血液排出體外后，必須防止或減少RNA降解。而血液RNA極易降解的原因之一是血漿中含有高濃度的RNA酶（RNase）。在一項(xiàng)研究中，血漿內(nèi)的游離RNA僅在15 秒鐘就發(fā)生降解，導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，RNA酶的威力由此可見(jiàn)一斑。因此，在采集全血時(shí)立即抑制RNA酶的活性至關(guān)重要，這樣才能確保采集高質(zhì)量的RNA，這對(duì)下游測(cè)序、生物標(biāo)記物鑒定和疾病診斷至關(guān)重要。

為了降低RNA的降解，特別是在開(kāi)展大規(guī)模血液轉(zhuǎn)錄組學(xué)項(xiàng)目時(shí)，我們建議使用專(zhuān)門(mén)RNA采血管收集血液，如PAXgene™全血RNA 采血管（BD, 762165）。該采血管含有能穩(wěn)定 RNA 的專(zhuān)有試劑，能產(chǎn)生準(zhǔn)確反映采樣時(shí)血液狀態(tài)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。

更重要的一點(diǎn)，采血管的樣本儲(chǔ)藏時(shí)間及RNA質(zhì)量的穩(wěn)定性，是大型多中心臨床研究的一個(gè)關(guān)鍵考慮因素。PAXgene全血RNA保存管（762165）內(nèi)含能夠穩(wěn)定體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄性狀的抗凝劑。抗凝劑能夠減少RNA在體外的降解，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)的RNA，并將基因誘導(dǎo)的水平降低到最小程度，被廣泛用于血液RNA樣本的保存。相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明，PAXgene™ 全血RNA 采血管中樣本在-80℃儲(chǔ)存7年后 ，提取的RNA 質(zhì)量與產(chǎn)量均較穩(wěn)定，樣本在-20℃中儲(chǔ)存11年后，RNA 質(zhì)量與采集當(dāng)天相比沒(méi)有降低。

另外，如下圖所示，在沒(méi)有珠蛋白耗竭的情況下，基因檢測(cè)率會(huì)降低。從血液中分離的RNA樣本中去除rRNA及珠蛋白mRNA，可釋放出更多寶貴的測(cè)序空間，并將測(cè)序讀數(shù)集中到最重要的部分。